Intro
Microbiome은 microbiota와 genome의 합성어로 각각의 의미는 다음과 같습니다.
* microbiota: ecological communities of commensal, symbiotic and pathogenic microorganisms
* genome: genetic material of an organism
즉, 인간, 동식물, 대기, 바다, 토양 등 주변 환경에 서식하는 microbe와 그들의 유전체 정보를 의미합니다. 최근에 신체 내, 외부에 공생하는 microbe가 비만, 아토피, 암 등 각종 질환과 밀접한 연관을 가지고 있다는 연구결과가 발표되고 있습니다. 건강한 삶에 대한 관심이 증가하면서 environmental microbiome 분야의 연구도 활발하게 이루어지고 있습니다.
본 포스트에서는 NGS 데이터를 활용한 microbiome analysis에 대해 관련 논문을 중심으로 살펴보겠습니다.
Understand of Microbiome Analysis
Microbiome 연구는 HTS(high-hroughput sequencing) 기술 발전과 함께 급격히 성장했고 다량의 데이터가 생산되고 있습니다. 분석 대상에 따라, HTS method에 따라 이들이 가지는 장점과 한계에 대해서 알아보겠습니다.
1. 분석 대상
1) Microbes: culturome
2) DNA: Amplicon(16S/18S/ITS), Metagenome, Virome
3) mRNA: Virome, Metatranscriptome
2. HTS method
1) Culturome: microbe-level에서 microbe를 배양하고 확인하는 방법입니다. bacterial stocks를 얻기 위한 가장 효율적인 방법이지만, 비용이 많이 들고 노동 집약적인 특징을 가집니다.
2) Amplicon (16S/18S/ITS): prokaryotes는 16S ribosome DNA (rDNA), eukaryotes는 18S rDNA와 internal transcribed spacers(ITS)를 포함한 영역을 주요 마커로 사용하여 amplicon sequencing을 진행하는 방법입니다. 주로 Illumina sequencer를 사용하며 paired-end 250bp 길이로 데이터를 생산합니다. 적은 양의 시료를 가진 샘플이나 host DNA에 contam된 샘플에 적용 가능하지만, 단지 genus-level까지만 확인할 수 있고 특정 primer와 PCR cycle 수에 민감한 특징을 가집니다.
3) Metagenome: amplicon 방식에 비해 더 많은 정보를 제공합니다. taxonomic 정보 뿐만이 아니라 functional 정보까지 얻을 수 있습니다. 하지만 상대적으로 비용이 많이 들고 분석시간이 오래 걸리는 특징을 가집니다.
4) Virome: DNA나 RNA를 가지는 virus 특성상 두 개 시료 모두 사용 가능하며 metagenome과 metatranscriptome 분석을 조합하여 사용합니다. 시료 양이 적으므로 virus enrichment나 host DNA 제거가 필수입니다. 하지만 가장 비용이 많이 들고 분석하기 어려운 특징을 가집니다.
5) Metatranscriptome: microbial community의 mRNA를 profiling 하고 gene expression level을 확인하며 functional 정보를 확인할 수 있습니다. 비용이 많이 들고 분석 방법이 복잡한 특징을 가집니다.
샘플 type과 정답을 알고자 원하는 질문 내용에 따라 HTS method를 선택합니다. 여러 가지 방식을 통합하여 분석하는 것이 권장되는데, 이러한 multi-omics 방식은 microbiome의 taxonomy와 function에 대한 insight를 제공하기 때문입니다.
Analysis Pipeline
Microbiome 분석을 위한 다양한 tool와 pipeline이 공개되어 있습니다. Amplicon/metagenomic 분석을 위한 current best-practice pipeline을 알아보겠습니다.
1. Amplicon analysis
1) QIIME/USEARCH 사용: raw reads를 feature table로 변환하는 과정
2) Step1 - demultiplexing: raw amplicon paired-end reads를 barcode sequence에 따라 grouping하는 단계
3) Step2 - merging: paired-end reads를 하나의 amplicon sequence로 합치고 barcode와 primer sequence를 제거하는 단계
4) Step3 - quality control: low-quality amplicon sequence를 제거하는 단계
5) Step4 - picking the representative sequences: amplicon 분석의 가장 중요한 단계로 두 가지 방식을 주로 사용
A) OTUs (operational taxonomic units): 97% 이상 동일한 sequence를 하나의 OTU로 clustering하는 방식 (UPARSE 알고리즘). 하지만 species나 strain 사이 미묘한 차이는 검출하지 못할 수 있음
B) ASVs (amplicon sequence variants): 동일한 sequence를 하나의 ASV로 clustering하는 방식 (denoising 알고리즘). OTU와 비슷하지만 1 base 차이만 나도 서로 다른 그룹으로 분리할 수 있으므로 더 정확하고 세밀한 분류가 가능. 최근 OTU보다 ASV를 더 많이 사용하는 추세이며 분석에 DADA2/Deblur tool 사용
6) Step5 - obtaining feature table (OTU/ASV table): 각 샘플마다 feature sequence의 빈도를 측정. 동시에 feature sequence에 kingdom, phylum, class, order, family, genus, and species level의 taxonomy를 할당
7) (additional) Step6 - functional prediction: 보통 amplicon sequencing은 taxonomic 정보만 얻는 목적으로 수행하지만 근래에 potential functional information을 예측하는 tool이 개발
A) PICRUSt: Greengenes DB의 OTU table 기반으로 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway의 metagenomic functional composition 예측
B) PICRUSt2: OTU/ASV table 기반으로 metagenomic functions 직접 예측
C) Tax4Fun: SILVA DB 기반으로 KEGG functional capabilities 예측
D) FAPROTAX pipeline: functional annotation of prokaryotic taxa. published metabolic & ecological functions 기반으로 functional annotation 수행하는 파이프라인
E) BugBase: Greengenes의 확장판 DB. oxygen tolerance, gram staining, pathogenic potential 같은 phenotype 예측할 때 사용. 주로 medical research 분야에서 사용
2. Metagenomic analysis
Amplicon 분석과 비교할 때 much higher resolution of taxonomic annotation 정보와 functional 정보까지 제공한다는 장점이 있습니다. 하지만 대량의 데이터를 다루어야 하므로 linux system에서 다량의 computing resources가 필요합니다.
1) Step1 - quality control & removal of host contamination: KneadData pipeline/Trimmomatic + Bowtie2 사용
2) Step2 - convert clean data into taxomomic and functional tables: reads-based method or/and assembly-based method 사용
A) reads-based method
a) clean reads를 DB에 align하고 feature table 생성
b) MetaPhlAn2, Kraken2 (lowest common ancestor 알고리즘), HUMAnN2, MEGAN 등 사용
B) assembly-based method
a) clean reads를 assemble하여 contig 만들고 gene abundance table 생성
b) MEGAHIT (quick & little memonry) or metaSPAdes (longer contigs & more computational resources) 사용
c) assembled contig 내 gene 확인: metaGeneMark or Prokka
d) redundant gene 제거: CD-HIT
e) gene abundance table 생성: Bowtie2 or Salmon
f) 일반적으로 존재하는 다량의 gene은 functional annotation에 따라 묶어서 KEGG Orthology (KO) module과 pathway와 같이 축소된 차원 형태로 나타냄
3) (additional) Step3 - to mine gene clusters or to assemble draft microbe genomes
A) to mine gene cluster
a) secondary metabolite biosynthesis와 연관된 gene cluster를 확인, annotation, visualization 하는데 antiSMASH DB 사용
B) to assemble draft microbe genomes
a) 기존에 알려진 microbe의 reference genome 숫자에 비해 자연에 존재하는 microbe의 숫자와 다양성은 훨씬 큼
b) 따라서 align하여 taxonomic & functional 정보 분석은 매우 제한됨
c) 이러한 한계를 극복하기 위해서 상호 연관성 있는 gene의 구간화 (binning)를 이용한 metagenome assembled genome (MAG) analysis를 사용하여 draft microbe genome을 구축함
d) binning tools: CONCOCT or MaxBin2 or MetaBAT2
e) binning pipelines: MetaWRAP or DAStool
Statistical Analysis and Visualization
Amplicon과 metagenomic analysis의 가장 중요한 결과물은 taxonomic & functional table입니다. 앞서 우리는 'Understand of Microbiome Analysis' 파트에서 정답을 알고자 원하는 질문 내용에 따라 적절한 HTS method를 선택해야 한다고 알아봤습니다. 마찬가지로 최종 결과물을 생성할 때에도 어떤 질문에 답변할 것인지에 따라 overall or details statistical analysis and visualization을 선택합니다.
Overall analysis는 feature table에서 alpha/beta- diversity와 taxonomic composition의 차이를 알아볼 때 사용합니다. Detail analysis는 comparison, correlation analysis, network analysis, machine learning 등을 사용한 biomarker 확인에 사용합니다.
1. Alpha diversity
Richness와 evenness 척도를 포함하여 하나의 샘플 내에서 diversity를 평가합니다.
1) QIIME or USEARCH 사용
2) 그룹 간의 alpha diversity 차이 측정: Analysis of Variance (ANOVA), Mann-Whitney U Test, KruskalWallis test 사용하여 통계적 평가
3) 이 때 각 그룹 비교시 두 번 이상 측정하는 경우 adjusted P-value 사용해야 함을 주의
2. Beta diversity
샘플 간 microbiome 구성 차이를 확인합니다.
1) 보통 차원 축소 방식의 조합으로 확인
2) principal coordinate analysis (PCoA), non-metric multidimensional scaling (NMDS), constrained principal coordinate analysis (CPCoA) 사용
3) beta diversity 간 통계적 차이 확인: permutational multivatiate analysis of variance (PERMANOVA) 사용
3. Taxonomic composition
1) microbial community에 존재하는 mocrobiota에 대한 설명
2) 결과는 a stacked bar plot으로 표현
4. Difference comparison
그룹 간 현저하게 차이를 보이는 features (such as species, genes, or pathways)를 확인합니다.
1) Welch's t-test, Mann-Whitney U test, Kriskal-Wallis test, ALDEx2, edgeR, STAMP, LEfSe 사용
2) 결과는 a volcano plot, Manhattan plot, extended error bar plot으로 표현
5. Correlation analysis
샘플의 metadata와 taxa 사이 상관관계를 보여줍니다. 예를 들어 taxa와 pH, longitude, latitude, clinical indices와 같은 환경요소 사이의 상관관게를 확인합니다. 또한 특정 시점에 microbiota에 영향을 주는 key environmental factors를 확인합니다.
6. Network analysis
전체적인 관점에서 features의 동시 발생을 탐색합니다. Correlation network의 속성은 co-occurring taxa 혹은 functional pathways 간의 잠재적 상호작용을 의미할 수 있습니다.
1) analysis: SparCC package 사용
2) visualization: R library igraph, Cytoscape, Gephi 사용
7. Machine learning
1) 데이터로부터 학습, pattern 확인, 결정 과정을 거치는 AI의 한 분야
2) microbiome 분야에서는 taxonomic classification, beta-diversity analysis, binning, compositional analysis of particular features 확인에 주로 사용
8. Treemap
1) phylogenetic tree 만들 때 사용
2) IQ-TREE (for big data), iTOL (online visualization. input 파일은 table2itol 사용), GraPhlAn (recommend) 사용
9. (additional) Analysis
1) microbial origin 확인: FEAST, SourceTracker 사용
2) host와 microorganism으로부터 genetic information을 통해 regulatory relationship 확인: genome-wide association analysis (GWAS) 사용
Summary
주변 환경에 서식하는 microbe 대부분은 아직 genomic information이 밝혀지지 않은 미지의 세계에 놓여 있습니다. Microbe가 사람의 삶에 미치는 영향이 지대하다는 사실이 밝혀지면서 관련 연구도 증가하는 추세입니다.
NGS를 활용한 microbiome analysis는 specimen과 HTS methods에 따라 장점과 한계가 명확합니다. 따라서 어떤 질문에 대한 답을 얻기 원하는지 명확하게 정리한 다음 목적에 맞는 방법을 선택하는 것이 효율적입니다.
분석은 amplicon 방식과 metagenomic 방식 두 가지로 분류할 수 있습니다.
Amplicon 방식은 16S/18S/ITS 영역 대상으로 250PE amplicon data를 생산합니다. OTU/ATVs로 알려진 representative sequence를 추려내고 taxonomic 정보를 annotation 하는 것이 분석의 핵심 과정입니다.
Metagenomic 방식은 대상에서 채취한 DNA 시료로부터 shotgun NGS data를 생산합니다. 마찬가지로 cleaned reads로부터 taxonomic & functional table을 만드는 과정이 핵심 단계입니다.
위에서 얻은 feature table은 이후 통계분석과 visualization tool을 활용하여 질문에 대한 알맞은 결과를 생산합니다.